• Chris Pratt trong vai Peter Quill / Star-Lord:
  Thủ lĩnh nửa người nửa Celestial của nhóm Vệ binh dải Ngân Hà, người bị bắt cóc khỏi Trái đất khi còn nhỏ và được nuôi dưỡng bởi một nhóm trộm và buôn lậu người ngoài hành tinh có tên là Ravagers.
• Zoe Saldaña trong vai Gamora:
  Một đứa trẻ mồ côi tìm cách chuộc lại những tội ác trong quá khứ của mình, được Thanos nhận nuôi và huấn luyện để trở thành sát thủ riêng của hắn.  Phiên bản gốc của Gamora, một thành viên của nhóm Vệ binh, đã bị giết bởi Thanos trong Avengers: Cuộc chiến vô cực (2018), nhưng cô đã trở lại như một phiên bản trẻ hơn của nhân vật du hành đến hiện tại trong Avengers: Hồi kết (2019); Saldaña đảm nhận vai thứ hai trong bộ phim này,  hiện đang là thủ lĩnh của Ravagers.
• Dave Bautista trong vai Drax the Destroyer: Một thành viên của nhóm Vệ binh và là một chiến binh có kỹ năng cao có gia đình bị Ronan tàn sát, dưới sự chỉ đạo của Thanos.
• Karen Gillan trong vai Nebula:
  Một thành viên của nhóm Vệ binh, một cựu Avenger, và là em gái nuôi của Gamora, người cũng giống như cô ấy, được huấn luyện bởi cha nuôi của họ là Thanos để trở thành sát thủ riêng của ông ta.  Gillan tin rằng Nebula đang phát triển thành một "con người hơi khác" và dễ dãi hơn khi cô ấy bắt đầu hồi phục tâm lý sau cái chết của Thanos, kẻ là nguồn gốc của sự ngược đãi và hành hạ cô ấy.  Theo Gunn, Tinh vân hiện "tốt và đã thay đổi" trong Vol. 3 , không giống như cô ấy trong hai bộ phim Guardians đầu tiên. Ông cũng tiết lộ rằng quá trình phát triển nhân vật của Nebula cho đến bộ phim này đã được lên kế hoạch trước kể từ phần phim đầu tiên.
• Pom Klementieff trong vai Mantis: Một thành viên của nhóm Vệ binh có sức mạnh đồng cảm và là em gái cùng cha khác mẹ của Quill.
• Vin Diesel trong vai Groot: Một thành viên của nhóm Vệ binh đồng thời là bạn thân của Rocket.
• Bradley Cooper trong vai Rocket:
  Thành viên của nhóm Vệ binh và cựu Avenger, là thợ săn tiền thưởng gấu trúc biến đổi gen , đồng thời là bậc thầy về vũ khí và chiến thuật quân sự.  Đạo diễn kiêm biên kịch James Gunn nói rằng bộ phim kể về câu chuyện của Rocket, bao gồm cả lai lịch của anh ấy và "anh ấy sẽ đi đâu", cùng với mối quan hệ của điều đó với các Vệ binh khác và kết thúc của sự lặp lại này của đội.  Bộ phim hoàn thành một vòng cung nhân vật đã được thiết lập trong Vệ binh dải Ngân Hà (2014) và Vệ binh dải Ngân Hà 2 (2017), và tiếp tục trong Cuộc chiến vô cực và Hồi kết.
• Will Poulter trong vai Adam Warlock: Một sinh vật nhân tạo mạnh mẽ được Sovereign tạo ra để tiêu diệt những Người bảo vệ.
• Elizabeth Debicki trong vai Ayesha: Nữ tư tế tối cao vàng và là thủ lĩnh của những người Sovereign. Trong vai trò đó, bà đã tạo ra Adam Warlock để tiêu diệt các Hộ vệ.
• Sylvester Stallone trong vai Stakar Ogord: Một Ravager cấp cao.

Ngoài ra, Sean Gunn đảm nhận vai Kraglin Obfonteri, một thành viên của nhóm Vệ binh và cựu chỉ huy thứ hai của Yondu Udonta trong Ravagers,  và Maria Bakalova lồng tiếng cho Cosmo the Spacedog, một thành viên của nhóm Vệ binh là một con chó khôn ngoan đã phát triển khả năng psionic sau khi được Liên Xô gửi vào vũ trụ.  Cosmo trước đây đã được thể hiện bởi các diễn viên chó Fred và Slate trong hai bộ phim Vệ binh dải Ngân Hà đầu tiên và The Guardians of the Galaxy Holiday Special (2022), tương ứng.  Chukwudi Iwuji vào vai High Evolutionary, một nhà khoa học chuyên về tiến hóa và là người tạo ra Rocket, người tìm cách cưỡng bức nâng cao tất cả các sinh vật sống thành một "chủng tộc đặc biệt", và Michael Rosenbaum đảm nhận vai diễn Martinex , một cấp cao -Ravager xếp hạng, từ Vol. 2.

Daniela Melchior và Nico Santos được chọn vào các vai không được tiết lộ, với vai diễn của Melchior được cho là một vai nhỏ.  Callie Brand sẽ xuất hiện như một người ngoài hành tinh.  Cũng dự kiến ​​xuất hiện trong phim là Lylla, một con rái cá hình người là cộng sự của Rocket.